10.3. МЕТОД ІЗОТОПНИХ ІНДИКАТОРІВ У ДОСЛІДЖЕННЯХ В ГАЛУЗІ БІОЛОГІЇ ТА ЕКОЛОГІЇ

3. Основні шляхи використання радіоактивних ізотопних індикаторів в дослідженнях з рослинами

За допомогою методу ізотопних індикаторів у біології рослин, зокрема фізіології, та агрохімії найчастіше вирішуються два основні завдан­ня: дослідження транспорту і розподілу в рослині окремих елементів та вивчення ролі окремих речовин в метаболізмі.

Сформульовані в найзагальнішому вигляді, вони проте охоплюють практично всі можливі шляхи використання методу в рам­ках експериментальної біології рослини: шляхи надходження, транспорту та утилізації елементів живлення в рослині через корені та листя; дослідження просторового розподілу окремих елементів та ре­човин в рослині; вивчення впливу різних типів живлення рослин на обмін окремих речовин та дослідження участі в обміні окремих спо­лук; оцінка швидкості пересування речовин по рослині та багато інших.

Треба підкреслити, що введений в рослину мічений елемент за­лучається в метаболізм, в процесі якого з ним можуть відбуватися різні хімічні перетворення. Безперечно, кінетика надходження і розпо­ділу елемента в значній мірі залежить від того, в якій формі він вводиться у рослину. Але в процесі включення в обмін речовин з ним можуть відбуватися певні метаболічні перетворення, внаслідок яких речовини "перемічуються", тобто мітка – ізотоп може потрапляти до складу зовсім інших сполук. Для ідентифікації того, в якій хі­мічній формі і до окладу якої сполуки включився мічений елемент, необхідно поєднувати метод ізотопних індикаторів з іншими фізіологічними, біохімічними, цитохімічними методами та засобами препаративного розділу і аналізу суміші речовин.

Дослідження транспорту та розподілу в рослинах окремих елементів. Кожний метод є логічним ланцюжком конкретних прийомів, які необхідно здійснювати при постановці та проведенні досліджень. Як типовий приклад такого завдання можна розглянути схему проведення експерименту з вивчення розподілу міченого елемента в рослині.

Дослід починається з вирощування рослини в умовах ґрунтової, піщаної або водяної культури до якого-небудь певного  віку або фази, передбаченої його цілями і завданнями. По досягненні цього періоду готують розчин міченої сполуки з заданою питомою активністю. Частіше вводять мічений елемент в складі якої-небудь сполу­ки через кореневу систему. Якщо рослина вирощується в умовах ґрунтової або піщаної культури, то це проводять шляхом поверхне­вого поливу субстрату розчином, який містить мічену речовину, і підгрунтовим його введенням через дренажну трубку. В умовах ґрун­тової культури для більш рівномірного розподілу розчини по посудині можна попередньо по колу гострим штирем зробити в ґрунті декіль­ка наскрізних вертикальних отворів. Завдання введення і рівномір­ного розподілу мітки значно полегшується при проведенні досліду в умовах водяної культури. Іноді мічена сполука вводиться в субст­рат ще при закладанні досліду перед посівом рослин. У цьому випад­ку вирішення питання рівномірного його розподілу по посудині також спрощується.

При позакореневому введенні ізотопу його нанесення звичайно проводиться двома шляхами: обприскуванням з пульверизатора або змочуванням поверхні листя. У випадку використання в майбутньому листя для аналізу з метою зняття з поверхні радіоактивних речовин їх відмивають водою і розчинами немічених солей, в фopмi яких вводилась мітка.

Існують і інші способи введення мітки в рослини. З них, в першу чергу, треба виділити ін'єкцію розчину ізотопу в провідну систему рослини за допомогою медичного шприца. Іноді використову­ють такі способи як поглинення розчину ізотопу "ґнотом" з листка, у якого відрізають бокові частини пластинки, а смужку, що залишилася з середньою жилкою („гніт”), занурюють в пробірку з ізотопом; всмоктування розчину з ізотопом через зріз черешка або пеньок бо­кового стебла; нанесення розчину з ізотопом на точку ро­сту.

При роботі з радіоактивними ізотопами, для котрих розробле­на розглянута схема, методика передбачає прижиттєве вивчення тра­нспорту і розподілу міченої сполуки в рослині. Для цього використовують виносні детектори радіоактивності, виготовлені звичайно на основі малогабаритних газороз­рядних лічильників Гейгера-Мюллера. За допомогою таких датчиків, підключених до радіометричної апаратури, можна реєструвати момент надходження мітки у той чи інший орган, оцінювати швидкість її пере­сування по стеблу і листку, а за ступенем радіоактивності визначи­ти і місця локалізації. Зрозуміло, що таким шляхом можливо лише дуже приблизно виявити характер пересування ізотопу по рослині, а тим більше дати кількісну оцінку його розподілу. Але при вміло­му використанні він може стати джерелом цінної, а іноді і зовсім унікальної інформації. Найбільш вдало даний засіб використовується в експериментах з великими рослинами - соняшником, кукурудзою, плодовими культурами, виноградом та іншими. В цьому випадку на рослині можна закріпити декілька датчиків і з досить високою точністю у перебігу онтогенезу рослини вивчати проце­си транспорту та нагромадження міченої сполуки в різних її орга­нах.

Для отримання більш змістовної картини розподілу міченого елементу по рослині або в окремому органі ви­користовують метод радіоавтографії, про який буде сказано далі.

Але найбільш точну кількісну картину транспорту і локаліза­ції в рослині міченого елемента можна одержати за допомогою раді­ометричного аналізу окремих частин і органів рослини. Для того на певних стадіях розвитку  рослини чи їх частини фіксують. Фіксація - це штучне умертвіння рослини. Вона є дуже відповідальною операцією, яка повинна забезпечити по можливості досить швидке, щоб не допустити перерозподі­лу мітки після завершення експерименту, припинення обміну речовин.

Найбільш досконалим способом фіксації вважається занурення рослин або окремих органів в рідкий азот (-196 °С), що забезпе­чує практично миттєву зупинку метаболізму. Застосовують теплову фіксацію – прогрів росли­н в термостаті при 105 °С, занурення в етиловий спирт, суміш спирту з оцтовою кислотою та деякі інші середовища. Але всі ці способи поступаються першому і при їх застосуванні харак­тер розподілу мічених сполук може дещо змінюватися. Щоб звести до мінімуму ці порушення, рослини розчленову­ють на окремі органи, подрібнюють і якнайшвидше піддають висушуванню в термостаті. Потім проби змелюють до порошкоподібного ста­ну і на радіометричному приладі оцінюють їх радіоактивність. Знання радіоактивності міченої сполуки, введеної в рослину, дає можливість розрахувати її кількість на орган і одиницю маси рослини.

Вивчення ролі окремих речовин в метаболізмі рослин. Коло питань, що вирішується попереднім дослідженням, може бути суттєво розширене за рахунок більш глибокого вивчення учас­ті міченої сполуки в процесі метаболізму. Виділяючи з окремих органів ро­слин певні речовини і визначаючи в них вміст ізотопу, можна про­слідкувати за метаболічними перетвореннями тої чи іншої сполуки. Саме таким шляхом були отримані за допомогою радіоактивних ізото­пів унікальні відомості про особливості фосфорного, кальцієвого, сірчаного обміну в рослині, про фізіологічну роль багатьох мі­кроелементів, фундаментальні дині про перетворення окремих речовин та інші.

Застосування методу мічених атомів дозволило більш глибоко вирішити питання про роль вуглецю у фотосинтезі. Тільки з можли­вістю одержання міченого вуглекислого газу ¹⁴СО₂ вдалося проникнути в таємниці зеленого листа, яке перетворює цю просту речовину у складні органічні сполуки. Цей шлях біосинтезу відомий під назвою циклу Кальвіна, або відновлювального пентозофосфатного циклу.

І В.В.Рачинський наводить схему досліду з вивчення хімічного перетворення вуглецю у фотосинтезі вже як типовий приклад вирішення задачі такого типу.

Згідно неї. підготовлену до досліду рослину разом з посудиною ставлять на певний час в камеру з міченим вуглекислим газом, який звичайно одержують шляхом додавання в пробірку зі злегка зволоженим міченим карбонатом барію (Ва¹⁴СО₃) 30 %-ї хлорної кислоти. Невелика камера може бу­ти створена для окремого листка. При цьому місце введення листка в камеру в зоні черешка, як і взагалі вся камера, повинно бути повітряно непроникним. У короткочасних дослідженнях з фотосинтезу можуть бути використані і зрізані з рослин окремі листки,  черешки яких зануре­ні в пробірки з водою,  поживним розчином, а у випадку вирішення певних завдань і безпосередньо в розчин з міченим карбонатом. Пі­сля експозиції рослини фіксують і проводять групове фракціонуван­ня вуглецевмісних речовин, у перебігу якого виділяють, наприклад, амінокислоти, органічні кислоти, білки, вуглеводи, ліпіди та інші сполуки. Далі за допомогою методів аналітичної біохімії - хроматогра­фії, електрофорезу та інших проводять розподіл цих речовий на індивідуальні хімічні сполуки і визначають їх радіоактивність.

В тому випадку, коли отримують паперові або тонкошарові хроматограми, електрофореграми з них можна зняти радіоавтографи (фотовідбитки), які відображають у повному смислі слова  картину розподілу радіоактивного міченого елемента у складі різних сполук, тобто у які сполуки включився вуглець. Радіометричний їх аналіз дозволяє кількісно оцінити динаміку розподілу вуглецю. Саме такі підходи і дозволили вивчити і описати шляхи фіксації і перетворення вуглецю при фотосинтезі.

Подібні прийоми дають можливість вирішувати завдання, пов'язані з вивченням poлі в метаболізмі і більш складних сполук: окремих амінокислот, ферментів, фізіологічно активних речовин, нарешті, навіть таких складних утворень як нуклеїнові кислоти. Дуже ефек­тивно використовується цей підхід в радіобіології для вивчення дії іонізуючих випромінювань на порушення окремих систем метабо­лізму, вияснення механізмів протирадіаційного захисту і післярадіа­ційного відновлення.