10.3. МЕТОД ІЗОТОПНИХ ІНДИКАТОРІВ У ДОСЛІДЖЕННЯХ В ГАЛУЗІ БІОЛОГІЇ ТА ЕКОЛОГІЇ

5. Радіоавтографія

Надзвичайно важливою перевагою радіоактивних ізотопів у порівнянні зі стабільними є їх властивість залишати, аналогічно видимому світ­лу, слід на фотоматеріалах. Ця їх здатність широко використовується для вивчення локалізації мічених сполук в окремих органах за допомогою методу радіоавтографії.

Радіоавтографія, або авторадіографія. - це спосіб вивчення розподілу радіоактивних речовин в досліджуваному об'єкті шляхом накладання на нього чутливих до іонізуючих випромінювань фото­матеріалів. Радіоактивні речовини, що містяться в об'єкті, начеб­то самі себе при цьому фотографують, завдяки чому і виникла назва методу. Фактично, саме за допомогою радіоавтографії А.Беккерель відкрив явище радіоактивності.

Суть фотографічного методу виявлення радіоактивності полягає в тому, що іонізуюче випромінювання, проходячи через фотоемульсію, взаємодіє з мікрокристалами галогенідів срібла - „зернами”, які входять до її складу. При цьому відбувається відновлення іонів срібла до нейтральних атомів, внаслідок чого утворюється так зване приховане зображення. Після проявлення і фіксації на шарі фотоемульсії в тих місцях, куди потрапило іонізуюче випромінювання, з'являються темні пля­ми. Ділянки, на які потрапила більша кількість частинок або квантів, бу­дуть більш темними, ніж ті куди їх потрапило менше.

Як і в світловій фотографії, під впливом іонізуючого випромі­нювання на звичайних фотоматеріалах утворюється негативне зобра­ження. Якщо на його основі одержати позитивний відбиток, то можна побачити, що найбільш світлі місця відповідають найбільшій інтен­сивності випромінювання, менш світлі - меншій інтенсивності, а темні - його відсутності. Таким чином, за ступенем засвічування фо­томатеріалів можна судити про інтенсивність випромінювання і, ві­дповідно, про кількість радіоактивної речовини, що міститься в будь-якій ділянці досліджуваного об’єкту.

Радіоавтограф, або авторадіограма, - це фотографічне зображення розподілу радіоактивних речовин в до­сліджуваному об'єкті, яке одержане за допомогою методу радіоавто­графії.

Ряд переваг радіоавтографії робить її унікальним мето­дом просторово-кількісного аналізу, котрий широко застосовується в ба­гатьох галузях природничих наук, їх прикладних сферах, а особливо в біології та медицині. Досить широко використовується вона і в дослідженнях з рослинами.

До головних переваг методу радіоавтографії слід віднести та­кі: можливість одержання просторової картини розподілу радіоакти­вної речовини, в тому числі і спеціально введеного радіоактивно­го ізотопу, в досліджуваному зразку; високу чутливість методу, основану на властивості певних фотоматеріалів реєструвати окремі частинки і кванти, що дає можливість виявити в зразку такі малі кількості радіоактивних речовин, які не можуть бути виявлені за допомогою лічильників радіоактивності; можливість кількісної оцін­ки нагромадження  речовини в різних ділянках досліджуваного об'єкту; можливість оцінки радіоактивності, а іноді і кількісного її визначення в дуже малих зразках, що порівнюються з розмірами дрібних кристаліті галогенідів срібла (десяті і соті долі мікрометра); одержання об'єктивного документа, що фіксує всі результат» досліду - радіоавтографа.

Як реєструючи середовища в радіоавтографії звичайно викорис­товуються фотографічні емульсії. Хоча в принципі з цією метою мо­жуть бути використані будь-які фотоматеріали, в яких під впливом іонізуючих частинок або квантів змінюється колір або його інтенсив­ність і які мають досить високу чутливість до випромінювань. Од­нак, чисельні дослідження показали, що найбільш зручний ма­теріалом є саме фотографічні емульсії. У порівнянні з іншими сві­тлочутливими середовищами вони мають низку поки неперевершених пе­реваг, що робить їх незамінними. Головна з них полягає в тому, що фотоемульсія здатна безперервно реєструвати радіоактивні розпади атомів, що дозволяє оцінювати їх сумарну кількість за час експози­ції препарату. Цe стає можливим тому, що вона протягом тижнів і місяців зберігає постійними свої фізичні властивості. Користую­чись цією особливістю емульсії, можна різко зменшити кількість радіоактивного препарату, який вводиться в рослину, що іноді бу­ває дуже важливим. Суттєвою перевагою емульсії є можливість з її допомогою локалізувати радіоактивні розпади в просторі та підрахувати їх кількість. Не можна не вра­ховувати і порівняну дешевизну цього матеріалу, фізичні властивос­ті якого можна легко регулювати, змінюючи розмір мікрокристалів галогенідів срібла – зерен.

Виділяють дві основні різновидності радіоавтографії – макрорадіоавтографію і мікрорадіоавтографію. В основі обох лежить принцип контактної радіоавтографії, при якому об’єкт дослідження безпосередньо контактує з фотоматеріалом, на відміну від слідової, яка звичайно використовується у ядерній фізиці.

Макрорадіоавтографія має справу з великими об’єктами – цілими рослинами, окремими органами – листками, квітками, зрізами плодів та іншими. При цьому фотоплівка або фото­пластинка прикладається до рівної поверхні зразка і притискується пресом. Після експонування і проявлення радіоавтограф аналізу­ється в прохідному світлі шляхом порівняння густини почорніння фо­томатеріалу.

Об’єктами мікрорадіоавтографії є мікроскопічні препарати – зрізи, давлені препарати, мазки та інші. При цьому розпла­влена рідка фотоемульсія безпосередньо наноситься на зразок, утворюючи при застиганні  щільно прилягаючий до зразка шар. Після експонування та проявлення радіоавтограф  разом з об'єктом досліджується під оптичним або електронним мікроскопом у відбитому, а у випадку прозорості об'­єкту і в прохідному світлі. Аналіз полягає у підрахунку слідів, що утворилися іонізуючими частинками у фотоемульсії на фоні різних тка­нинних та клітинних структур.

Безперечно, другий метод має значно більш високі розділяючи можливості, ніж перший. Якщо для одержання макрорадіоавтографів використовують фотоматеріали з великими мікрокристалами - зернами розміром 0,2-0,5 мкм (звичайні aбo рентгенівські фотопластинки або фотоплівки), то для отримання мікрорадіоавтографів застосовують осо­бливі дрібнозернисті ядерні фотоемульсії з зер­нами розміром 0,01-0,02 мкм.

Для одержання радіоавтографів в рослину тим чи іншим спосо­бом, але частіше все ж таки через кореневу систему, разом з пожив­ним середовищем вводять речовину, яка містить радіоактивний ізотоп. Для отримання макрорадіоавтографів через деякий час (години-доби), що визначається завданням та метою досліджень, зрізують окремі листки або інші органи чи беруть все рослину цілком, кла­дуть на фільтрувальний папір, розправляють як для гербарію і звер­ху також накривають фільтрувальним папером. Підготовлений таким чином об'єкт розміщують між двома рівними металевими пластинками і під пресом кладуть в сушильну шафу при температурі 80-85 ⁰C. Після повного висушування в фотографічній кімнаті при слабкому темно-червоному або спеціальному жовто-зеленому світлі на нього накладають фотоплівку або фотопластинку, накривають м'якою ткани­ною і знову під пресом кладуть в світлонепроникну камеру або спеціальну касету. Остання операція повинна забезпечити максимально можливий контакт рослини з фотоемульсією.

Експонування, тривалість якого залежите від багатьох факто­рів, але головним чином визначається кількістю радіоактивної ре­човини, що надійшла в рослину, і оцінюється експериментально, складає звичайно доби-тижні, але  може досягати і місяці. Після проявлення одержують макрорадіоавтограф, щ характеризує розподіл інкорпорованого радіоактивного ізотопу в рослині. При необхідності з отриманого негативу можна виготовити позитивний відбиток на фотопапері.

Нерідко виникає потреба одержати макрорадіоавтограф зі свіжої ще вологої росини (наприклад, при роботі з короткоживучими ізотопами). В цьому випадку зразок обкладають водонепроникною прокладкою із полімерної плівки тоді розміщують на поверхні фотоматеріалу. Можна, навпаки, загорнути фотоплівку. Головне при цьому - не допустити попадання вологи на фотоемульсію, особливо у місці її контакту з рослиною, так як навіть незначна кількість вологи може викликати при експонуванні дифузію галогенідів срібла із фотошару в зразок і викривити картину радіоавтографа.

Для мікрорадіоавтографії звичайно використовують фіксовані препарати окремих органів або тканин рослини, в яку введений paдіоактивний ізотоп, виготовлені за загальноприйнятими методиками цитології та гістології. На висушені препарати наносять фотоемульсію, експонують, проявляють і одержують мікрорадіоавтографи, на яких під мікроскопом можна виявити потемніння певних ділянок у вигляді окремих точок, розмір яких визначається розміром зерен срібла, утворених ними скупчень.

Метод радіоавтографії дозволяє не тільки виявляти локалізацію міченої сполуки в рослині, тканині або клітині, але й оцінити її кількість, оскільки кількість зерен відновленого срібла емульсії прямо пропорційна інтенсивності діючого на нього випромінювання. Кількісний аналіз макрорадіоавтографів проводять за допомогою звичайних методів фо­тометрії, а мікрорадіоавтографів - підрахунком під мікроскопом зерен, що приходяться на одиницю площі або окрему структуру, наприклад, ядро, хромосому. В останні роки для цих цілей успішно використовуються автоматизовані методи кількісної цитофотометрії.

Можливості застосування методу радіоавтографії до кінця ще не вичерпані. З відкриттям нових фотоматеріалів, винайденням нових приладів у поєднанні з новими методичними підходами аналітичної хімії та біохімії, цитології і гістології сфера його застосування в найрізноманітніших областях біології з кож­ним роком розширюється.