10.3. МЕТОД ІЗОТОПНИХ ІНДИКАТОРІВ У ДОСЛІДЖЕННЯХ В ГАЛУЗІ БІОЛОГІЇ ТА ЕКОЛОГІЇ

1. Суть методу

Одним з шляхів практичного використання досягнень ядерної фізи­ки в різних галузях господарства і науки є використання методу ізотопних індикаторів, або, як ще його називають, методу мічених атомів.

Міченими атомами називають ізотопи, котрі, відрізняючись по масі від атому елемента, можуть використовуватись як мітка (індикатор) при вивченні найрізноманітніших процесів розподілу, переміщення і перетворення речовин у скільки завгодно складних системах, в тому числі і в живих організмах.

Як мітку - ізотопний індикатор використовують не тільки ра­діоактивні, а і стабільні ізотопи. Але при використанні радіоактивних ізотопів певне значення може мати біологічна дія їх іонізуючих випромінювань. Тому метод ізотопних індикаторів базується на двох положеннях:

- хі­мічні властивості різних ізотопів одного елемента практично однако­ві, завдяки чому їх поведінка в процесах, які вивчаються, не відрізняється від поведінки інших атомів того ж елементу;

- радіоактивні ізотопи у кількостях, що застосовуються у якості мітки, не чинять біологічної дії на живі організми.

Багато радіологів вважають, що метод ізотопних індикаторів не належить безпосередньо до кола інтересів радіобіології. І взага­лі з цім можна погодитись. Але не можна не враховувати, що своїм народженням цей метод, як і радіобіологія, завдячує відкриттю яви­ща радіоактивності, відкриттю саме радіоактивних ізотопів, котрі набагато частіше, ніж стабільні, використовуються як мітка.

Більш того, угорський хімік Д.Хевеші та німецький хімік Ф.Панет, які винайшли і запропонували цей метод в 1913 році, вперше застосували його саме в біологічних експериментах. І з того часу наука про дію іонізуючих випромінювань на живі організми і вчення про використання радіоактивних ізотопів в біології ідуть паралельно. Не випадково багато авторів, розглядаючи проблему використання до­сягнень ядерної фізики і радіобіології в сільському господарстві, поряд з радіаційно-біологічними технологіями як самостійний напря­мок або окремий підхід виділяють використання методу ізотопних індикаторів в дослідницьких та прикладних роботах в галузі як рослин­ництва, так і тваринництва.

Саме тому знайдено доцільним включен­ня глави про цей метод в підручник по радіобіології для агрономічних спеціальностей. Тим більше, що агроному-науковцю, особливо спеціалісту в галузі агрохімії, ґрунтознавства, захисту рослин, фізіології рослин нерідко приходиться використовувати його в своїй роботі для вирішення найрізноманітніших завдань. Не випадково саме з курсом "Застосування ізотопів в сільському господарстві” в свій час прийшла радіобіологія як дисципліна у вищий аграрний заклад освіти.

Але, звичайно, використання методу ізотопних індикаторів не обмежується інтересами радіобіології і навіть біології в цілому. Важко назвати напрямок в природничих науках і сферу в галузі господарства, де б він в наш час не застосовувався. Він використову­ється у медицині і медичній промисловості, хімії і хімічній проми­словості, геології, фізиці, металургії, матеріалознавстві, археоло­гії. Широкого застосування метод набув у сільському господарстві для оцінки фізичних властивостей ґрунту і запасів в ньому елементів жив­лення, для вивчення взаємодії ґрунту та добрив, процесів засвоєн­ня рослинами елементів живлення з ґрунту і добрив, позакореневого надходження в рослини елементів, для виявлення дії на рослинний організм пестицидів, вивчення особливостей обміну речовин сільсь­когосподарських рослин. Застосовуючи метод ізотопних індикаторів, досліджують найважливіші  властивості польових і плодових рослин – ріст і розвиток, особливості окремих процесів обміну, стійкість до різних несприятливих факторів навколишнього середовища, продуктивність.

В тваринництві за допомогою цього методу вивчають фізіологі­чні процеси, що протікають в організмі тварин, проводять аналіз корму на вміст токсичних речовин, малі кількості яких важко, а іноді і неможливо визначити за допомогою інших методів, використову­ють його для вивчення міграції комах-шкідників сільськогосподар­ських рослин і переносників хвороб сільськогосподарських тварин, поведінки бджіл, оцінки рибних запасів місцевих водоймищ, а також в багатьох інших сферах сільськогосподарського виробництва.

Слід підкреслити, що чутливість методу ізотопних індикаторів, особливо це стосується використання радіоактивних ізотопів, надзвичайно висока. Вона на багато порядків перевищує чутливість хімічних та інших фізичних методів. Саме тому завдяки методу мічених атомів вдалося вирішити багато завдань, котрі принципово неможливо було вирішити за допомогою інших підходів.

В агрохімічних та фізіологічних дослідженнях найчастіше використовують такі ізотопи: стабільні – ²Н, ¹³С, ¹⁵N, ¹⁸О та радіоактивні (в дужках вказаний тип випромінювання та період піврозпаду) – ³Н (бета-, 12,26 року), ¹⁴С (бета-, 5730 років), ²²Na (гамма-, 2,64 року), ³²Р (бета-, 14,3 доби), ³⁵S (бета-, 87 діб), ⁴²К (бета-, гамма-, 12,5 год.), ⁴⁵Са (бета-, 152 доби), ⁵⁹Fe (бета-, гамма-, 45,1 доби), ⁶⁰Со (бета-, гамма-, 5,27 року), ⁶⁵Zn (гамма-, 250 діб), ⁸⁶Rb (бета-, гамма-, 19,5 доби).

Так звану ізотопну сировину - речовину, що складається з чис­того ізотопу, одержують шляхом послідовних складних операцій, які мають назву „ізотопного розділу” на спеціальних розподільних прис­троях. З їх допомогою в наш час звичайно отримують стабільні ізо­топи. Що стосується радіоактивних ізотопів, то їх одержують або шляхом опромінення нерадіоактивних речовин в атомних реакторах і прискорювачах заряджених частинок (по аналогії з ⁶⁰Co для опромінюючих пристроїв, про що коротко розповідалось в попередньому розділі цієї гла­ви), або шляхом хімічного виділення з суміші відходів ядерного палива (по аналогії з ¹³⁷Cs ).

Мічені сполуки - це хімічні речовини, в яких атоми одного елемента, іноді декількох елементів, мають ізотопний склад, що відрізняється від природного. Мічені сполуки одержують за допомогою трьох основних методів: хімічного синтезу, ізотопного обміну (іноді їх об’єднують під загальною назвою – хімічний шлях) та біологічного синтезу (біологічний шлях).

 Хімічний синтез, як правило. здійснюється за допомогою звича­йних методів препаративної хімії. Але на певному етапі синтезу до складу реакційних компонентів замість звичайного елементу включа­ється потрібний ізотоп.

Ізотопний обмін - це хімічний процес, який полягає в перероз­поділі ізотопів якого-небудь елемента між реагуючими речовинами. При ізотопному обміні відбувається заміщення одного ізотопу елемен­та на інший в молекулі речовини без зміни їх елементарного складу. Наприклад:  ⁴²КСl + NaOH = ⁴²KOH + NaCl

Мічені високомолекулярні сполуки біологічного походження, такі як нуклеїнові кислоти, білки, ферменти, деякі амінокислоти, гормони, вітаміни та інші, хімічний синтез яких ускладнений або не можливий і котрі не завжди вступають в реакції ізотопного обміну, отримують шляхом культивації різних організмів іn vivo або in vitro на середовищах, що містять ізотоп, або введення ізотопу в організм за допомогою яких-небудь інших методів, з наступним препаративним виділенням цих сполук. Таким способом далеко не завжди вдається отримати мічену сполуку з досить високим вмістом ізотопу (високою питомою активністю ізотопу), але нерідко цей шлях є єдиним можливим для отримання міченої речовини біологічного походження.

2. Мічені сполуки і добрива

Одним з головних завдані, не тільки агрохімії, але й агрономії в цілому є розробка раціональних заходів використання сільськогос­подарськими рослинами елементів живлення. В зв'язку з цим виникає необхідність застосування прямих методів у вивченні використання рослинами внесених в грунт добрив. Це може бути здійснене тільки за допомогою мічених добрив.

Методи хімічного аналізу можуть дати лише загальні відомості про кількість елементів живлення в рослині або ґрунті. Метод ізотопних індикаторів дозволяє простежити долю конкретного елемента, що внесений з добривом або утилізований в ґрунті до його внесення. Він дозволяє кількісно просліджувати за надходженням, транспортом та засвоєнням певного елемента, оцінити швидкість йогo пересуван­ня по рослині, нагромадження в окремих органах з точністю, яка на 5-10 порядків перевищує точність хімічних аналізів. Саме тому в наш час метод ізотопних індикаторів набуває значення одного з ос­новних методів агрофізіологічних досліджень.

При проведенні агрохімічних досліджень або робіт в області фізіології мінерального живлення рослин з використанням методу ізо­топних індикаторів необхідно мати мічені добрива. Основними вимогами до якості міченого добрива, як і до будь-якої міченої сполуки, є такі: ізотоп-індикатор повинен перебувати у такій же хімічній фо­рмі, що і елемент живлення в складі добрива; він пови­нен бути рівномірно розподілений по всій масі добрива; кількість його повинна бути достатньою для визна­чення відповідними вимірювальними приладами, але не викликати будь-яких суттєвих відхилень у перебігу біологічних процесів.

У якості індикаторів в добривах використовують і стабілі­ні і радіоактивні ізотопи. Головною перевагою стабільних ізотопів є відсут­ність  іонізуючих випромінювань. Однак, лише невелика кількість елементів мають придатні для агрофізіологічних досліджень стабільні ізотопи. Мала їх доступність, порівняно складна техніка виявлен­ня і відносно низька чутливість складають головні недоліки методик з використанням стабільних ізотопів.

В цьому відношенні радіоактивні ізотопи мають такі незаперечні переваги: можливість їх отримання практично для всіх елементів періодичної си­стеми, надзвичайно висока чутливість і точність визначення, відно­сна доступність вимірювальних приладів. Саме тому більшість дослід­жень із застосуванням методу ізотопних індикаторів проводиться са­ме з радіоактивними ізотопами.

Існують радіоактивні ізотопи і всіх без винятку елементів жив­лення. Однак з ізотопів-макроелементів вище означені переваги мають лише ³²Р, ³⁵S, ⁴⁵Ca, а з ізотопів-мікроелементів – ⁵⁹Fe, ⁶⁰Co, ⁶⁵Zn та деякі інші. Що стосується інших елементів, то невеликий період піврозпаду робить практично неможливим їх використання в довготривалому експерименті по вивченню, наприклад, транспорту елемента, його включення в метаболізм з точним кількісним підрахунком. Так, період піврозпаду найбільш довгоживучого радіоактивного ізотопу азоту ¹³N складає лише 10 хвилин. Радіоактивний ізотоп калію ⁴⁰К має великий період піврозпаду - більше мільярда ро­ків, але дуже низьку радіоактивність і не може використовуватись для точних оцінок. Його штучний аналог ізотоп ⁴²К має достатню радіоактивність, але короткий період піврозпаду – 12,4 години. Короткий період піврозпаду у радіоактивного ізотопу міді - ⁶⁴Cu – 12,8 години, молібдену ⁹⁹Мо - 67 годин, деяких інших мікроелементів. Ці ізотопи звичайно використовують лише у спеціальних короткочас­них експериментах, наприклад, для вивчення окремих етапів їх надходження в рослини, швидкості всмоктування через корені, локалі­зації в листі при позакореневому внесенні та подібних.

Тому для отримання мічених азотних добрив застосовують стабільний ізотоп азоту ¹⁵N. Для вивчення транспорту та утилізації калію взагалі немає придатного стабільного або радіоактивного ізо­топу і замість нього використовують штучний радіоактивний ізотоп рубідію ⁸⁶Rb з періодом піврозпаду 19,5 діб - елемента, який звичайно зустрічається в природі як ізоморфна домішка в калії і вважається його близьким хімічним аналогом. Специфічна дія рубідію на рос­лини, як, між іншим, і на інші організми, на відміну від його аналогу натрію, невідома.

Існує два основних способи одержання мічених добрив. Перший з них передбачає введення мітки в добриво в процесі йогo отриман­ня по заводській технології, Наприклад, розчин, що містить радіо­активний фосфат кальцію Са₃(³²РО₄)₂, нерадіоакти­вна сіль якого складає основу природних фосфатів (фосфориту і апа­титу) або апатитового концентрату, додають до сірчаної кислоти, якою вони обробляються при отриманні звичайного простого суперфосфату, або до фосфорної кислоти - при отриманні подвійного суперфосфату.

Аналогічним шляхом можуть бути одержані мічені азотні і ка­лійні добрива, коли в процесі виготовлення в залежності від хімічної основи добрива до них додають мічені солі (¹⁵NН₄)₂SO₄, ¹⁵NH₄Cl, ¹⁵NH₄NO₃ або її різновиди за місцем мітки: NH₄¹⁵NO₃, ¹⁵NH₄¹⁵NO₃, ⁸⁶RbCl, ⁸⁶Rb₂SО₄. Цей спосіб отримання мічених добрив найбільш досконалий, так як включення ізотопу в технологічний процес виробництва добрив дозволяє досягти рівномірного розподілу мітки по всій його масі. Але цілком очевидно, що цей спосіб досить дорогий, так як потре­бує створення в заводських умовах спеціальної технологічної лінії або її відтворення в конкретних експериментальних умовах.

Другий спосіб більш простий і тому частіше використовується в дослідницьких цілях. Він полягає в простому змішуванні розчину радіоактивної солі з водяною суспензією готового добрива в лабора­торних умовах. Після цього суспензія висушується до вихідної воло­гості добрива. Цей спосіб є менш досконалим, але цілком придатним за умов, що досягається рівномірний розподіл мітки по всій масі добрива. У випадках, коли добриво, представлене простою сіллю (на­приклад, аміачна селітра, хлористий калій) і змішується з такою ж сіллю, можна отримати мічене добриво, що не поступається за якістю виготовленому за першим способом.

Ще простіше готуються мічені рідкі поживні розчини і середовища для водяних та піщаних культур. В цьому випадку, у відповідно­сті до складу поживної суміші, частина солі, яка повинна нести конкретну мітку, замінюється препаратом, що містить ізотоп.

Важливим моментом при приготуванні добрив або поживного роз­чину, мічених радіоактивним ізотопом, є вибір індикаторної дози ізотопу. З одного боку, вона повинна бути достатньо високою, щоб забезпечити точність в оцінці участі в метаболізмі рослини досліджуваного елемента. Але з другого, - не настільки високою, щоб спричинити радіаційну дію. При цьому слід враховувати, що не тільки інгібуюча дія ізотопу, але й стимулююча може викривити картину надходження і перетворення елемента. Не­обхідно також виключити можливий вилив випромінювання на експериментатора та радіоактивне забруднення навколишнього середовища у випадку проведення експерименту в польових умовах або в умовах вегетаційного будиночка.

Тому вибір індикаторної дози є важливим, хоча і складним завданням. При його вирішенні необхідно враховувати цілі і завдання експерименту, спе­цифіку ізотопу та сполуки, до складу якої він входить, радіочут­ливість виду рослини, можливості вимірювальних приладів, умови проведення експерименту та інше. В дослідах з рослинами приблизний інтервал індикаторних доз, як правило, знаходиться в діапазоні 10³-10⁴ Бк/л(кг) поживного розчину, середовища або ґрунту. Індикаторні дози для досліджень з ссавцями з урахуванням їх, як правило, більш високої радіочутливості, приблизно на порядок нижчі.

При проведенні короткочасних дослідів, тривалість яких вимірюється годинами-днями, верхня межа індикаторних доз з метою збі­льшення чутливості методу може бути зміщена у бік більш високих концентрацій. Навпаки, у довготривалих експериментах, що продов­жуються місяцями, наприклад, при внесенні мічених добрив в грунт, - в бік більш низьких концентрацій.

Оцінити індикаторну дозу розрахунковим шляхом – досить складне завдання, яке до того ж вирішується дуже орієнтовно. Тому в кожному конкретному випадку бажано ставити попередні контрольні досліди, які можуть допомогти визначити необхідну кількість радіоактивного ізотопу, що забезпечить оптимальні умови проведення експерименту як з точки зору одержання достовірних даних, так і радіаційної безпеки експериментатора.

3. Основні шляхи використання радіоактивних ізотопних індикаторів в дослідженнях з рослинами

За допомогою методу ізотопних індикаторів у біології рослин, зокрема фізіології, та агрохімії найчастіше вирішуються два основні завдан­ня: дослідження транспорту і розподілу в рослині окремих елементів та вивчення ролі окремих речовин в метаболізмі.

Сформульовані в найзагальнішому вигляді, вони проте охоплюють практично всі можливі шляхи використання методу в рам­ках експериментальної біології рослини: шляхи надходження, транспорту та утилізації елементів живлення в рослині через корені та листя; дослідження просторового розподілу окремих елементів та ре­човин в рослині; вивчення впливу різних типів живлення рослин на обмін окремих речовин та дослідження участі в обміні окремих спо­лук; оцінка швидкості пересування речовин по рослині та багато інших.

Треба підкреслити, що введений в рослину мічений елемент за­лучається в метаболізм, в процесі якого з ним можуть відбуватися різні хімічні перетворення. Безперечно, кінетика надходження і розпо­ділу елемента в значній мірі залежить від того, в якій формі він вводиться у рослину. Але в процесі включення в обмін речовин з ним можуть відбуватися певні метаболічні перетворення, внаслідок яких речовини "перемічуються", тобто мітка – ізотоп може потрапляти до складу зовсім інших сполук. Для ідентифікації того, в якій хі­мічній формі і до окладу якої сполуки включився мічений елемент, необхідно поєднувати метод ізотопних індикаторів з іншими фізіологічними, біохімічними, цитохімічними методами та засобами препаративного розділу і аналізу суміші речовин.

Дослідження транспорту та розподілу в рослинах окремих елементів. Кожний метод є логічним ланцюжком конкретних прийомів, які необхідно здійснювати при постановці та проведенні досліджень. Як типовий приклад такого завдання можна розглянути схему проведення експерименту з вивчення розподілу міченого елемента в рослині.

Дослід починається з вирощування рослини в умовах ґрунтової, піщаної або водяної культури до якого-небудь певного  віку або фази, передбаченої його цілями і завданнями. По досягненні цього періоду готують розчин міченої сполуки з заданою питомою активністю. Частіше вводять мічений елемент в складі якої-небудь сполу­ки через кореневу систему. Якщо рослина вирощується в умовах ґрунтової або піщаної культури, то це проводять шляхом поверхне­вого поливу субстрату розчином, який містить мічену речовину, і підгрунтовим його введенням через дренажну трубку. В умовах ґрун­тової культури для більш рівномірного розподілу розчини по посудині можна попередньо по колу гострим штирем зробити в ґрунті декіль­ка наскрізних вертикальних отворів. Завдання введення і рівномір­ного розподілу мітки значно полегшується при проведенні досліду в умовах водяної культури. Іноді мічена сполука вводиться в субст­рат ще при закладанні досліду перед посівом рослин. У цьому випад­ку вирішення питання рівномірного його розподілу по посудині також спрощується.

При позакореневому введенні ізотопу його нанесення звичайно проводиться двома шляхами: обприскуванням з пульверизатора або змочуванням поверхні листя. У випадку використання в майбутньому листя для аналізу з метою зняття з поверхні радіоактивних речовин їх відмивають водою і розчинами немічених солей, в фopмi яких вводилась мітка.

Існують і інші способи введення мітки в рослини. З них, в першу чергу, треба виділити ін'єкцію розчину ізотопу в провідну систему рослини за допомогою медичного шприца. Іноді використову­ють такі способи як поглинення розчину ізотопу "ґнотом" з листка, у якого відрізають бокові частини пластинки, а смужку, що залишилася з середньою жилкою („гніт”), занурюють в пробірку з ізотопом; всмоктування розчину з ізотопом через зріз черешка або пеньок бо­кового стебла; нанесення розчину з ізотопом на точку ро­сту.

При роботі з радіоактивними ізотопами, для котрих розробле­на розглянута схема, методика передбачає прижиттєве вивчення тра­нспорту і розподілу міченої сполуки в рослині. Для цього використовують виносні детектори радіоактивності, виготовлені звичайно на основі малогабаритних газороз­рядних лічильників Гейгера-Мюллера. За допомогою таких датчиків, підключених до радіометричної апаратури, можна реєструвати момент надходження мітки у той чи інший орган, оцінювати швидкість її пере­сування по стеблу і листку, а за ступенем радіоактивності визначи­ти і місця локалізації. Зрозуміло, що таким шляхом можливо лише дуже приблизно виявити характер пересування ізотопу по рослині, а тим більше дати кількісну оцінку його розподілу. Але при вміло­му використанні він може стати джерелом цінної, а іноді і зовсім унікальної інформації. Найбільш вдало даний засіб використовується в експериментах з великими рослинами - соняшником, кукурудзою, плодовими культурами, виноградом та іншими. В цьому випадку на рослині можна закріпити декілька датчиків і з досить високою точністю у перебігу онтогенезу рослини вивчати проце­си транспорту та нагромадження міченої сполуки в різних її орга­нах.

Для отримання більш змістовної картини розподілу міченого елементу по рослині або в окремому органі ви­користовують метод радіоавтографії, про який буде сказано далі.

Але найбільш точну кількісну картину транспорту і локаліза­ції в рослині міченого елемента можна одержати за допомогою раді­ометричного аналізу окремих частин і органів рослини. Для того на певних стадіях розвитку  рослини чи їх частини фіксують. Фіксація - це штучне умертвіння рослини. Вона є дуже відповідальною операцією, яка повинна забезпечити по можливості досить швидке, щоб не допустити перерозподі­лу мітки після завершення експерименту, припинення обміну речовин.

Найбільш досконалим способом фіксації вважається занурення рослин або окремих органів в рідкий азот (-196 °С), що забезпе­чує практично миттєву зупинку метаболізму. Застосовують теплову фіксацію – прогрів росли­н в термостаті при 105 °С, занурення в етиловий спирт, суміш спирту з оцтовою кислотою та деякі інші середовища. Але всі ці способи поступаються першому і при їх застосуванні харак­тер розподілу мічених сполук може дещо змінюватися. Щоб звести до мінімуму ці порушення, рослини розчленову­ють на окремі органи, подрібнюють і якнайшвидше піддають висушуванню в термостаті. Потім проби змелюють до порошкоподібного ста­ну і на радіометричному приладі оцінюють їх радіоактивність. Знання радіоактивності міченої сполуки, введеної в рослину, дає можливість розрахувати її кількість на орган і одиницю маси рослини.

Вивчення ролі окремих речовин в метаболізмі рослин. Коло питань, що вирішується попереднім дослідженням, може бути суттєво розширене за рахунок більш глибокого вивчення учас­ті міченої сполуки в процесі метаболізму. Виділяючи з окремих органів ро­слин певні речовини і визначаючи в них вміст ізотопу, можна про­слідкувати за метаболічними перетвореннями тої чи іншої сполуки. Саме таким шляхом були отримані за допомогою радіоактивних ізото­пів унікальні відомості про особливості фосфорного, кальцієвого, сірчаного обміну в рослині, про фізіологічну роль багатьох мі­кроелементів, фундаментальні дині про перетворення окремих речовин та інші.

Застосування методу мічених атомів дозволило більш глибоко вирішити питання про роль вуглецю у фотосинтезі. Тільки з можли­вістю одержання міченого вуглекислого газу ¹⁴СО₂ вдалося проникнути в таємниці зеленого листа, яке перетворює цю просту речовину у складні органічні сполуки. Цей шлях біосинтезу відомий під назвою циклу Кальвіна, або відновлювального пентозофосфатного циклу.

І В.В.Рачинський наводить схему досліду з вивчення хімічного перетворення вуглецю у фотосинтезі вже як типовий приклад вирішення задачі такого типу.

Згідно неї. підготовлену до досліду рослину разом з посудиною ставлять на певний час в камеру з міченим вуглекислим газом, який звичайно одержують шляхом додавання в пробірку зі злегка зволоженим міченим карбонатом барію (Ва¹⁴СО₃) 30 %-ї хлорної кислоти. Невелика камера може бу­ти створена для окремого листка. При цьому місце введення листка в камеру в зоні черешка, як і взагалі вся камера, повинно бути повітряно непроникним. У короткочасних дослідженнях з фотосинтезу можуть бути використані і зрізані з рослин окремі листки,  черешки яких зануре­ні в пробірки з водою,  поживним розчином, а у випадку вирішення певних завдань і безпосередньо в розчин з міченим карбонатом. Пі­сля експозиції рослини фіксують і проводять групове фракціонуван­ня вуглецевмісних речовин, у перебігу якого виділяють, наприклад, амінокислоти, органічні кислоти, білки, вуглеводи, ліпіди та інші сполуки. Далі за допомогою методів аналітичної біохімії - хроматогра­фії, електрофорезу та інших проводять розподіл цих речовий на індивідуальні хімічні сполуки і визначають їх радіоактивність.

В тому випадку, коли отримують паперові або тонкошарові хроматограми, електрофореграми з них можна зняти радіоавтографи (фотовідбитки), які відображають у повному смислі слова  картину розподілу радіоактивного міченого елемента у складі різних сполук, тобто у які сполуки включився вуглець. Радіометричний їх аналіз дозволяє кількісно оцінити динаміку розподілу вуглецю. Саме такі підходи і дозволили вивчити і описати шляхи фіксації і перетворення вуглецю при фотосинтезі.

Подібні прийоми дають можливість вирішувати завдання, пов'язані з вивченням poлі в метаболізмі і більш складних сполук: окремих амінокислот, ферментів, фізіологічно активних речовин, нарешті, навіть таких складних утворень як нуклеїнові кислоти. Дуже ефек­тивно використовується цей підхід в радіобіології для вивчення дії іонізуючих випромінювань на порушення окремих систем метабо­лізму, вияснення механізмів протирадіаційного захисту і післярадіа­ційного відновлення.

4. Особливості застосування радіоактивних ізотопів у вегетаційних та польових дослідженнях

Для вивчення надходження та транспорту окремих елементів в рослину використовують і звичайну техніку постановки вегетаційних дослідів. При цьому слід дотримуватись запобіжних заходів проти поширення радіоактивного забруднення, що в умовах вегетаційного досліду, а тим більш у полі, здійснити значно важче, ніж в лабораторії.

На рисунку для прикладу наведена схема двокомпонентної вегетаційної посудини, яка використовується для вивчення надходження елементів живлення в різні органи рослин арахісу.  Корені рослини розміщені у 15-літровій посудині,  а плодоносні органи, які ростуть також у ґрунті, в окремій  чашці. Кожна зона рослини мо­же отримувати елементи живлення окремо. За таких умов легко про­слідкувати долю будь-якого міченого елементу, що вводиться в рослину тим чи іншим шляхом, в тому числі і через надземні органи, його поглинання, транспорт і розподіл в коренях, листках, плодах. Саме у подібних дослідах з радіоактивними ізотопами була доведена більш висока ефективність підживлення рос­лин через листя у порівнянні з іншими видами підживлення такими елементами як фосфор, калій і сірка, які швидко поглинаю­ться листям і рухаються по флоемі до інших органів. Водночас бу­ло показано, що кальцій, магній, залізо, мідь легко поглинаються листками, але пересуваються з них повільно і на незначні відстані.

Особливості поглинання елементів живлення рослинам з добрив за допомогою методу ізотопних індикаторів можуть бути добре вивче­ні в польових умовах, тобто максимально наближених до природних умов вирощування рослин. В цьому випадку важливим завданням є вне­сення в грунт мічених добрив, виготовлених за будь-яким з вище­описаних способів. В дослідах з однорічними рослинами мічене доб­риво, як і звичайне, може вноситись перед посівом (посадкою) при ретельному перемішуванні його з ґрунтом. В експериментах з багато­річними рослинами або внесенні мічених добрив під вегетуючу одно­річну рослину, наприклад, в період формування продуктивних орга­нів, використовують два способи внесення - поверхневий та глибин­ний.

Прийоми внесення мічених добрив в польових умовах під росли­ни винограду, описані американським дослідником А.Ульріхом, прий­нято вважати типовими. За його методикою при поверхневому внесен­ні навколо виноградної лози влаштовують з ґрунту грядку або лунку зі стороною квадрату або діаметром 120 см. Спочатку для  зволоження в грядку  вливають 40 л води, а потім 20 л води з розчиненим міченим добривом. Після того, як розчин просочить грунт, додають ще 100 л води для більш рівномірного його розподілу в зоні кореневої системи.

При глибинному внесенні мічених добрив в кожному кутку квад­ратної грядки або лунки (якщо лунка кругла, то в місцях перетину з окружністю двох взаємно перпендикулярних її діаметрів) просвердлюють отвори діаметром 4 см і глибиною 40 см. Всю дозу добрива розчиняють у 600 мл води і розподіляють порівну по чотирьох отворах навкруг лози. Зараз же після цього під кожну лозу вносять по 150 л води.

Описані методики з урахуванням видової специфіки, фази розвитку чи віку придатні для внесення мічених добрив під вегетуючі од­норічні рослини, під плодові культури та інші.

Іноді для глибинного внесення мічених добрив під вегетуючі рослини використовують спеціальні зонди, що діють за принципом шприца. Такий зонд являє собою досить тонку, щоб не пошкодити коре­неву систему, загострену на кінці сталеву трубку звичайно діаметром близько 10 мм і довжиною, що забезпечує внесення добрива на не­обхідну глибину, оснащену поршнем або іншим механізмом впорскування розчину.

Дуже важливим при проведенні польових дослідів з радіоактив­ними ізотопами є дотримання мір радіаційної безпеки для запобіган­ня забруднення ділянки. Досліди в польових умовах украй бажано проводи­ти з коротко- та середньоживучими ізотопами, наприклад, застосовувати ⁸⁹Sr замість ⁹⁰Sr, ¹³⁴Сs замість ¹³⁷Сs.

На відміну від лабораторних досліджень з ізотопами, працюючи в умовах вегетаційного або польового експерименту з десятками, со­тнями або й тисячами рослин, вносячи мічені сполуки в різні фази їх розвитку, проводячи відбір проб і оцінку радіоактивності протя­гом всього вегетаційного періоду, можна дослідити особли­вості динаміка надходження, розподілу та нагромадження мічених сполук в окремих органах в ході онтогенезу і визначити вплив най­різноманітніших факторів на ці процеси.

Саме у вегетаційних та польових дослідженнях з міченими доб­ривами та іншими сполуками вдалося оцінити ефективність викорис­тання різних елементів живлення добрив в залежності від їх форми, способу внесення, типу ґрунту, видових особливостей рослин; вста­новити справжні швидкості рухливості різних елементів живлення, фізіологічно активних речовин та інших сполук в залежності від способу внесення; виявити особливості поглинання рослинами елемен­тів живлення з різних типів добрив та багато іншого.

Безумовно, в умовах вегетаційних та польових досліджень з радіоактивними ізотопами можна вирішувати і завдання, пов'язані з перетвореннями у процесі метаболізму різних речовин, які були опи­сані вище. Більше того, в цих умовах, як уже відзначалося, наближених до природних, одержувані результати бу­дуть більш близькі до реальних.

5. Радіоавтографія

Надзвичайно важливою перевагою радіоактивних ізотопів у порівнянні зі стабільними є їх властивість залишати, аналогічно видимому світ­лу, слід на фотоматеріалах. Ця їх здатність широко використовується для вивчення локалізації мічених сполук в окремих органах за допомогою методу радіоавтографії.

Радіоавтографія, або авторадіографія. - це спосіб вивчення розподілу радіоактивних речовин в досліджуваному об'єкті шляхом накладання на нього чутливих до іонізуючих випромінювань фото­матеріалів. Радіоактивні речовини, що містяться в об'єкті, начеб­то самі себе при цьому фотографують, завдяки чому і виникла назва методу. Фактично, саме за допомогою радіоавтографії А.Беккерель відкрив явище радіоактивності.

Суть фотографічного методу виявлення радіоактивності полягає в тому, що іонізуюче випромінювання, проходячи через фотоемульсію, взаємодіє з мікрокристалами галогенідів срібла - „зернами”, які входять до її складу. При цьому відбувається відновлення іонів срібла до нейтральних атомів, внаслідок чого утворюється так зване приховане зображення. Після проявлення і фіксації на шарі фотоемульсії в тих місцях, куди потрапило іонізуюче випромінювання, з'являються темні пля­ми. Ділянки, на які потрапила більша кількість частинок або квантів, бу­дуть більш темними, ніж ті куди їх потрапило менше.

Як і в світловій фотографії, під впливом іонізуючого випромі­нювання на звичайних фотоматеріалах утворюється негативне зобра­ження. Якщо на його основі одержати позитивний відбиток, то можна побачити, що найбільш світлі місця відповідають найбільшій інтен­сивності випромінювання, менш світлі - меншій інтенсивності, а темні - його відсутності. Таким чином, за ступенем засвічування фо­томатеріалів можна судити про інтенсивність випромінювання і, ві­дповідно, про кількість радіоактивної речовини, що міститься в будь-якій ділянці досліджуваного об’єкту.

Радіоавтограф, або авторадіограма, - це фотографічне зображення розподілу радіоактивних речовин в до­сліджуваному об'єкті, яке одержане за допомогою методу радіоавто­графії.

Ряд переваг радіоавтографії робить її унікальним мето­дом просторово-кількісного аналізу, котрий широко застосовується в ба­гатьох галузях природничих наук, їх прикладних сферах, а особливо в біології та медицині. Досить широко використовується вона і в дослідженнях з рослинами.

До головних переваг методу радіоавтографії слід віднести та­кі: можливість одержання просторової картини розподілу радіоакти­вної речовини, в тому числі і спеціально введеного радіоактивно­го ізотопу, в досліджуваному зразку; високу чутливість методу, основану на властивості певних фотоматеріалів реєструвати окремі частинки і кванти, що дає можливість виявити в зразку такі малі кількості радіоактивних речовин, які не можуть бути виявлені за допомогою лічильників радіоактивності; можливість кількісної оцін­ки нагромадження  речовини в різних ділянках досліджуваного об'єкту; можливість оцінки радіоактивності, а іноді і кількісного її визначення в дуже малих зразках, що порівнюються з розмірами дрібних кристаліті галогенідів срібла (десяті і соті долі мікрометра); одержання об'єктивного документа, що фіксує всі результат» досліду - радіоавтографа.

Як реєструючи середовища в радіоавтографії звичайно викорис­товуються фотографічні емульсії. Хоча в принципі з цією метою мо­жуть бути використані будь-які фотоматеріали, в яких під впливом іонізуючих частинок або квантів змінюється колір або його інтенсив­ність і які мають досить високу чутливість до випромінювань. Од­нак, чисельні дослідження показали, що найбільш зручний ма­теріалом є саме фотографічні емульсії. У порівнянні з іншими сві­тлочутливими середовищами вони мають низку поки неперевершених пе­реваг, що робить їх незамінними. Головна з них полягає в тому, що фотоемульсія здатна безперервно реєструвати радіоактивні розпади атомів, що дозволяє оцінювати їх сумарну кількість за час експози­ції препарату. Цe стає можливим тому, що вона протягом тижнів і місяців зберігає постійними свої фізичні властивості. Користую­чись цією особливістю емульсії, можна різко зменшити кількість радіоактивного препарату, який вводиться в рослину, що іноді бу­ває дуже важливим. Суттєвою перевагою емульсії є можливість з її допомогою локалізувати радіоактивні розпади в просторі та підрахувати їх кількість. Не можна не вра­ховувати і порівняну дешевизну цього матеріалу, фізичні властивос­ті якого можна легко регулювати, змінюючи розмір мікрокристалів галогенідів срібла – зерен.

Виділяють дві основні різновидності радіоавтографії – макрорадіоавтографію і мікрорадіоавтографію. В основі обох лежить принцип контактної радіоавтографії, при якому об’єкт дослідження безпосередньо контактує з фотоматеріалом, на відміну від слідової, яка звичайно використовується у ядерній фізиці.

Макрорадіоавтографія має справу з великими об’єктами – цілими рослинами, окремими органами – листками, квітками, зрізами плодів та іншими. При цьому фотоплівка або фото­пластинка прикладається до рівної поверхні зразка і притискується пресом. Після експонування і проявлення радіоавтограф аналізу­ється в прохідному світлі шляхом порівняння густини почорніння фо­томатеріалу.

Об’єктами мікрорадіоавтографії є мікроскопічні препарати – зрізи, давлені препарати, мазки та інші. При цьому розпла­влена рідка фотоемульсія безпосередньо наноситься на зразок, утворюючи при застиганні  щільно прилягаючий до зразка шар. Після експонування та проявлення радіоавтограф  разом з об'єктом досліджується під оптичним або електронним мікроскопом у відбитому, а у випадку прозорості об'­єкту і в прохідному світлі. Аналіз полягає у підрахунку слідів, що утворилися іонізуючими частинками у фотоемульсії на фоні різних тка­нинних та клітинних структур.

Безперечно, другий метод має значно більш високі розділяючи можливості, ніж перший. Якщо для одержання макрорадіоавтографів використовують фотоматеріали з великими мікрокристалами - зернами розміром 0,2-0,5 мкм (звичайні aбo рентгенівські фотопластинки або фотоплівки), то для отримання мікрорадіоавтографів застосовують осо­бливі дрібнозернисті ядерні фотоемульсії з зер­нами розміром 0,01-0,02 мкм.

Для одержання радіоавтографів в рослину тим чи іншим спосо­бом, але частіше все ж таки через кореневу систему, разом з пожив­ним середовищем вводять речовину, яка містить радіоактивний ізотоп. Для отримання макрорадіоавтографів через деякий час (години-доби), що визначається завданням та метою досліджень, зрізують окремі листки або інші органи чи беруть все рослину цілком, кла­дуть на фільтрувальний папір, розправляють як для гербарію і звер­ху також накривають фільтрувальним папером. Підготовлений таким чином об'єкт розміщують між двома рівними металевими пластинками і під пресом кладуть в сушильну шафу при температурі 80-85 ⁰C. Після повного висушування в фотографічній кімнаті при слабкому темно-червоному або спеціальному жовто-зеленому світлі на нього накладають фотоплівку або фотопластинку, накривають м'якою ткани­ною і знову під пресом кладуть в світлонепроникну камеру або спеціальну касету. Остання операція повинна забезпечити максимально можливий контакт рослини з фотоемульсією.

Експонування, тривалість якого залежите від багатьох факто­рів, але головним чином визначається кількістю радіоактивної ре­човини, що надійшла в рослину, і оцінюється експериментально, складає звичайно доби-тижні, але  може досягати і місяці. Після проявлення одержують макрорадіоавтограф, щ характеризує розподіл інкорпорованого радіоактивного ізотопу в рослині. При необхідності з отриманого негативу можна виготовити позитивний відбиток на фотопапері.

Нерідко виникає потреба одержати макрорадіоавтограф зі свіжої ще вологої росини (наприклад, при роботі з короткоживучими ізотопами). В цьому випадку зразок обкладають водонепроникною прокладкою із полімерної плівки тоді розміщують на поверхні фотоматеріалу. Можна, навпаки, загорнути фотоплівку. Головне при цьому - не допустити попадання вологи на фотоемульсію, особливо у місці її контакту з рослиною, так як навіть незначна кількість вологи може викликати при експонуванні дифузію галогенідів срібла із фотошару в зразок і викривити картину радіоавтографа.

Для мікрорадіоавтографії звичайно використовують фіксовані препарати окремих органів або тканин рослини, в яку введений paдіоактивний ізотоп, виготовлені за загальноприйнятими методиками цитології та гістології. На висушені препарати наносять фотоемульсію, експонують, проявляють і одержують мікрорадіоавтографи, на яких під мікроскопом можна виявити потемніння певних ділянок у вигляді окремих точок, розмір яких визначається розміром зерен срібла, утворених ними скупчень.

Метод радіоавтографії дозволяє не тільки виявляти локалізацію міченої сполуки в рослині, тканині або клітині, але й оцінити її кількість, оскільки кількість зерен відновленого срібла емульсії прямо пропорційна інтенсивності діючого на нього випромінювання. Кількісний аналіз макрорадіоавтографів проводять за допомогою звичайних методів фо­тометрії, а мікрорадіоавтографів - підрахунком під мікроскопом зерен, що приходяться на одиницю площі або окрему структуру, наприклад, ядро, хромосому. В останні роки для цих цілей успішно використовуються автоматизовані методи кількісної цитофотометрії.

Можливості застосування методу радіоавтографії до кінця ще не вичерпані. З відкриттям нових фотоматеріалів, винайденням нових приладів у поєднанні з новими методичними підходами аналітичної хімії та біохімії, цитології і гістології сфера його застосування в найрізноманітніших областях біології з кож­ним роком розширюється.

6. Особливості використання стабільних ізотопів

З зв'язку зі значно нижчою чутливістю методу можливості зас­тосування в ролі мітки стабільних ізотопів в агробіологічних дослі­дженнях, як, до речі, і в багатьох інших, більш обмежені у порівнянні з радіоактивними ізотопами. Проте, стабільні ізотопи як індикатори можна застосовувати для вирішення практично всіх завдань, в яких використовуються радіоактивні ізотопи, хоча, як правило, з меншим успіхом і точністю.

Початкові стадії методик із застосуванням стабільних ізотопів не відрізняються від тих, де використовуються радіоактивні ізотопи. Специфіка методу проявляється лише на заключних етапах кількісного аналізу проб. Цей аналіз прово­дять на мас-спектрометрах - приладах, які призначені для розділення речовини за масами атомів і молекул. Принцип робо­ти мас-спектрометра оснований на дії магнітних і електричних по­лів на іонізовані пучки частинок у вакуумі з наступ­ним їх сортуванням за атомними масами.

Із згаданих на початку підрозділу стабільних ізотопів найбільш широко використовуваним в агрофізіологічних та агрохімічних дослідженнях є ізотоп азоту ¹⁵N. Роботи з ним ведуться за такими основними напря­мками: вивчення швидкості поглинання рослинами вільного азоту та азоту, що входять до складу різних азотистих сполук, в тому числі і добрив; визначення здатності до фіксації атмосферного азоту у різних видів рослин та вивчення швидкості процесів обміну азотистих сполук в рослинах.

В галузі агрохімії і ґрунтознавства використання ¹⁵N спри­яло значному поширенню і поглибленню уявлень про трансформацію в ґрунті азоту самого ґрунту та азоту добрив, які в нього вносяться, зокрема, про суть процесів мобілізації та іммобілізації ґрунтового азоту, роль окремих видів мікроорганізмів при цьому. Застосування ¹⁵N в дослідах по живленню і обміну речовин в рослинах сприяло відкриттям, які дозволили проникнути в суть ме­ханізму початкових процесів засвоєння азоту і з'ясувати важливі сторони взаємодії між азотним живленням, фотосинтезом, забезпеченістю рослин іншими мінеральними елементами.

При цьому переваги прийомів і методів дослідження азоту на основі  ізотопу ¹⁵N у порівнянні зі звичайними хімічними та агрохімічними настільки очевидні і загальновідомі, що важко зрозуміти, чому до тепер так обмежено використовуються. Відомий спеці­аліст в галузі використання цього ізотопу при роботі з рослинами американський агрохімік Р.Мак-Вікар відмічає, що  головна причина цього полягає в утрудненості визначення вмісту ¹⁵N в будь-якому об'єкті, так як з цією метою доводися вимірювати співвідношення молекулярних мас ¹⁵N і ¹⁴N  на  дорогих і складних в експлуатації  приладах – згаданих  мас-спектрометрах.

В чому ж полягають особливості застосування стабільних ізо­топів, зокрема ізотопу ¹⁵N, у порівнянні з радіоактивними?

Відомо, що природний азот складається з двох стабільних ізо­топів – ¹⁴N (99,63 %) та ¹⁵N (0,37 %). Живі організми не проявляють вибірковості у відношенні їх асиміляції, завдяки чому ¹⁵N може бути застосований в сполуках, що містять його до 60 %. Ступінь збагачення міченої сполуки ізотопом ¹⁵N характери­зується величиною, яка являє собою різницю (в атомних процентах) між вмістом ¹⁵N в цій міченій сполуці та його вмістом в природній суміші ізотопів азоту. Цю величину називають надлишком атомного проценту ¹⁵N. Так, наприклад, якщо вміст ¹⁵N у якій-небудь міченій сполуці дорівнюватиме 0,48 %, то надлишок атомного проценту складе 0,48 - 0,37 = 0,11.

Мас-спектрометричному аналізу піддають аналізу суміш ізотопів у газоподібному стані. Для цього досліджуваний матеріал спалюють за загально відомим методом Кьєльдаля, а одержаний із сірчанокислого амонію аміак окислюють у вакуумі гіпобромітом до вільного азоту. Найменший надлишок атомного проценту, який можна виявити в пробі, складає 0,01-0,02, що відповідає приблизно 0,1-0,2 мкг ¹⁵N в 1 мл азоту за нормальних умов. Це досить висока точність.

І все ж таки, чутливість методу ізотопних індикаторів з використанням стабільних ізотопів не йде ні в які порівняння з чутливістю методу з використанням радіоактивних ізотопів. Якщо для першого межа точності оцінки вмісту ізотопу в зразках складає 10^-4-10^-6 %, то за допомогою дру­гого можна фіксувати випромінювання ізотопу при кількості його в пробі в залежності від типу ізотопу 10^-11-10^-19%. Тому не дивно, що при можливості вибору дослідники завжди віддають перевагу методу радіоактивних ізотопів. На превеликий жаль, у випадку з азотом такого вибору немає.

В цілому ж з усією впевненістю можна констатувати, що завдяки широкому застосуванню методу ізотопних індикаторів як з використанням радіоактивних, так і стабільних ізотопів за останні десятиліття докорінно змінився експериментальний рівень багатьох біологічних дисциплін. Метод надзвичайно прискорив і поглибив процес пізнання основних закономірностей життя. Саме завдяки йо­му отримали потужній поштовх до розвитку такі області біологіч­ної науки, як молекулярна і клітинна біологія, молекулярна гене­тика, клітинна інженерія, біохімія, фізіологія та багато інших.

В радіобіології мічені атоми давно стали ефективним інструментом для вирішення багатьох важливих проблем. За допомогою ізотопів вивчаються порушення процесів метаболізму при радіаційному ураженні та променевій хвороби, закономірності кінетики клітин в уражених критичних органах, механізмі дії різних радіомодифікуючих агентів, хід процесів післярадіаційного відновлення та багато інших.

Але цілком впевнено можна сказати, що і зараз далеко не досягнуті, а часом ще і не визначені межі застосування методу ізотопних індикаторів.  Йому, особливо у поєднанні з іншими прийомами і методами, підкоряються все нові й нові області досліджень. Унікальним і чудовим   методом озброїла ядерна фізика біологів.

7. Контрольні запитання до лекції 10.3

1. Поняття мічених атомів. Стабільні та радіоактивні ізотопи. Приклади.

2. Способи одержання мічених добрив. Вимоги до їх якості.

3. Основні шляхи використання методу мічених атомів в дослідженнях з

    рослинами.

4. Суть методу радіоавтографії і його переваги в порівнянні з іншими

    способами застосування методу ізотопних індикаторів.

5. Застосування ізотопу ¹⁵N для вивчення азотного обміну в рослинах.